结核病检验技术

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结核病是由结核分枝杆菌引起的疾病，是目前世界范围内由单一感染源造成死亡的主要原因。早期、快速和准确的结核分枝杆菌鉴定和药敏的确定对这种疾病的治疗和管理至关重要。结核病的诊断主要依靠胸片、涂片镜检和细菌学培养。涂片镜检具有不同的敏感性，主要用于同时感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的患者。

由于结核分枝杆菌生长缓慢，常规培养分离、鉴定和药敏试验需要数周时间。结果时间的延迟导致潜在不适当的抗结核病治疗的延长，导致耐药性的出现，减少治疗方案，增加治疗时间和相关成本，导致死亡率和发病率增加。由于这些原因，需要新的诊断方法来及时识别结核分枝杆菌和确定感染菌株的抗生素敏感性。

分子方法提高了敏感性和特异性，提供了早期检测和检测混合感染的能力。这些技术提高了周转时间、成本效益，并适用于护理点测试。然而，尽管这些方法在采集样本数小时内就能得到结果，但仍然需要进行表型敏感性测试来确定药物敏感性，并量化给定菌株对单个抗生素的敏感性水平。

耐多药结核（MDR-TB）：至少对异烟肼和利福平这两个最强有力的抗结核药品产生耐药。

广泛耐药结核（XDR-TB）：除耐多药结核之外，对任何氟喹诺酮类药物以及三种二线注射药物（硫酸卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星）中至少一种具耐药性的结核。

镜检：涂片染色镜检，是最古老的结核病诊断技术。

齐-尼(Ziehl-Neelsen)染色法：简单、快速、廉价。虽然该方法的特异性很高，但据报道其敏感性在20%到80%之间变化。涂片镜检的敏感性在儿童、肺外结核患者和hiv感染患者中尤其低。不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌(NTM)。

金胺-罗丹明染色法：比齐-尼(Ziehl-Neelsen)染色法快，灵敏度提高了近10%。灵敏度的提高可以减少分析样本的数量，从而减少工作量并加快诊断速度。但荧光显微镜的维护成本高。不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌(NTM)。

发光二极管(LED)荧光显微镜：LED应用于荧光显微镜，降低了显微镜的维护成本；可以依靠电池运行，不需要暗室进行样品检查。LED荧光显微镜与光学显微镜一样无法区分死菌和活菌，且人眼观察易受疲劳和主观经验等因素限制。

培养：分枝杆菌培养灵敏度和特异性高，特别是与分子技术结合时，仍然是实验室诊断结核病的金标准，可以进行物种鉴定、药敏试验、监测药物治疗的反应和流行病学研究。

以鸡卵为基础的培养基：罗氏（L?wenstein-Jensen，L-J）培养基：培养时间较长，大约在4-8周，不利于临床快速检测的需求，但作为其他快速诊断的参照，以及作为结核杆菌诊断的标准有非常重要的意义。在固体培养基中，罗氏培养基是分枝杆菌生长使用最广泛的培养基。

Ogawa培养基：用途与罗氏培养基相同，成分较少，价廉。

琼脂培养基：Middlebrook7H10、7H11：该系列培养基主要用于分枝杆菌培养及药物敏感性测定。7H10、7H11为固体培养基。

液体培养基：Middlebrook7H9；分枝杆菌生长指示剂管（MGIT）。

培养系统：可用的市售液体基培养系统分手动，半自动或使用比色法或荧光法自动进行的。通常使用的液体介质是Middlebrook7H9或MGIT介质。

BD公司的BACTECMB,BACTECMGIT和，manualMGIT,Septi-ChekAFB系统，其中BACTECMGIT全自动荧光检测系统，是目前全球最快的分枝杆菌培养、鉴定、药敏系统。

Difco公司的ESP系统，是一种全自动的血培养系统，可以连续监测细菌的生长，无放射性。

OrganonTeknika公司的MB/BacT分枝杆菌培养系统，采用Middlebrook7H9液体培养基，当有阳性信号时，需取培养液进行涂片及鉴定确认。

药敏：药物敏感性测定为结核病化疗及控制的重要依据之一。结核分枝杆菌药敏试验所用的培养基、药物浓度、接种菌量和结果解释等均较特殊。常用培养基为琼脂(MB7H10或MB7H11)或罗氏培养基。

结核药敏的常规检测方法有三种，即绝对浓度法，电阻比法和比例法。前两种方法非常准确，但繁琐而冗长。比例法与患者的临床结果相关性良好，是结核分枝杆菌药敏试验的金标准。WHO/IUATLD全球结核病耐药检测方案中推荐比例法，目前国外普遍采用此法。国内多采用绝对浓度法。

另外，BACTEC系列培养系统、ESP系统等都可用于药敏试验。????

表型方法是结核分枝杆菌药敏试验的金标准，但它们耗时(固体培养基可能需要4-8周，液体培养基可能需要21天)，并且需要专门的基础设施和训练有素的实验室人员，难以满足临床对结核病快速和特异性诊断的要求。

??????????免疫学检验：

结核菌素皮肤试验（TST）通常使用Mantoux技术进行，该技术包括皮内注射2个结核菌素单位（TU）的RT-23或5个结核菌素单位的纯化蛋白衍生物（PPD-S），结果报告为硬结的横向直径。但是，PPDTST的特异性相对较低，对免疫抑制的个体（例如，HIV感染者）缺乏敏感性，并且需要两次就诊（一次进行检查，一次进行结果读取）。另一个挑战是，如果未能在48-72小时内到门诊评估结果，此次测试将无效。???????????????????????

γ干扰素（IFN）释放试验（IGRA）有两种方法：

基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的全血方法和基于酶联免疫吸附斑点（ELIS-POT）的测定。ELISA全血测试以试管形式使用来自RD1的ESAT-6和CFP-10的抗原肽，以及非RD1抗原的另一种抗原肽。结果报告为每毫升含有IFN-γ进行定量（国际单位，IU）。

ELISPOT是基于分离并计数的外周血单核细胞（PBMC）进行的，其与ESAT-6和CFP-10肽一起孵育。结果报告为产生IFN-γ的T细胞（斑点形成细胞）的数量。与TST相比，IGRA不受卡介苗（BCG）疫苗接种状况的影响，因此可用于评估接种BCG疫苗的个体的潜伏性结核感染，尤其是在婴儿出生后接种BCG疫苗或复种疫苗的国家。但是，IGRA平台的运行成本更高，需要专门的试剂盒、合格的技术人员和经过认证的实验室。

分子诊断技术：随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子诊断方法被应用于结核病临床诊断。

截止至年，结核病分子诊断的里程碑如下图所示：

用于筛选结核分枝杆菌耐药相关突变的基因分析的主要特征如下图表。表格呈现了试验方法、应用技术、针对的基因、对应的药物及用到的探针情况。

注：EMB：乙胺丁醇；FQ：喹诺酮类；INH：异烟肼；KAN：卡那霉素；MDRTB：耐多药结核；MTB：结核分枝杆菌；MUT：突变；NTM：非结核分枝杆菌；QRDR：喹诺酮耐药决定区；IF：利福平；RRDR：利福平耐药决定区；SLID：二线注射药物；STR：链霉素；TB：结核病；WT：野生型。

通过使用BACTECTB或MGIT确定的线探针测定法鉴定的最常见突变的基因型与表型的相关性如下表。表中呈现了药物种类、浓度、目标基因及其突变位点和突变后常表现的耐药程度情况。

下图为结核病未来诊断算法中当前诊断工作流程和整合表型方法的概述，多项技术联合使用，能更早、更快、更准确的诊断治疗结核病。

MTB利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(GeneXpertmycobacteriumtuberculosis/rifampin，GeneXpertMTB/ＲIF)：该技术可从待测标本中检测出MTB复合群同时判断其耐药性(仅针对利福平)，引物和探针是依据单拷贝基因rpoB耐药决定区而设计，对操作人员的技术水平要求低，整个检测过程安全无污染在密闭环境进行，2h即可出结果。WHO在年发文：当成人和儿童患者怀疑为耐多药结核病（multidrugresistance，MDR-TB）或合并艾滋病病毒（HIV）感染时，推荐XpertMTB/RIF为首选检测方法。

环介导等温扩增技术(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)：LAMP是以核酸扩增为基础的实验技术，该技术克服了聚合酶链反应技术需要热循环设备价格高以及对操作人员技术要求高等缺点，同时该技术采用4个MTB特异性引物以识别目标DNA上的6个不同的特异性区域以缩短反应时间并提高反应的特异度及灵敏度。LAMP实验过程中不需要热循环仪器进行DNA扩增，具有快速、特异、灵敏和稳定等优点。LAMP也存在不足，由于该检测法是针对MTB的DNA为靶序列设计引物同时进行扩增，对死菌也表现为阳性结果，因此该方法不能对临床抗结核治疗效果进行监测，且实验过程中DNA双链结构稳定不易降解。

交叉引物恒温扩增技术（crossingprimingamplification，CPA）：该方法与LAMP类似，通过1对特异性探针和2对特异性扩增引物，在恒温条件下，通过BstDNA聚合酶，对MTB复合群IS片段进行特异性扩增，然后利用免疫层析乳胶标记的试纸条进行检测。CPA是我国自主创新的核酸扩增技术，用于体外定性检测痰液样本中MTB的DNA，辅助TB的临床诊断，具有快速、简单、灵活、稳定的优点。

实时荧光恒温扩增检测技术（simultaneoousamplificationandtestingmethod，SAT）：采用了RNA扩增方式进行检测，标靶和扩增物均是RNA，因而有极高的扩增效率且反应稳定，在TB检测上具有灵敏、便捷的优点。

基因芯片技术：基因芯片是将根据MTB全基因组中保守的功能基因序列和SNP位点而设计的探针固定在一定的载体上，再加入荧光标记的待测样本核酸，通过分析荧光杂交信号来进行菌株鉴定，细菌基因分型，耐药性分析等;当前临床常用的有基因检测芯片，菌种分型芯片和耐药检测芯片等。基因芯片技术可以快速直接对痰标本MTB进行耐药性检测，检测结果具备较好的特异度与灵敏度，可以为临床结核病的诊治提供快速准确的实验室检测数据。但其敏感性不如GeneXpertMTB/ＲIF技术。

MTBDRplus技术：耐多药结核病（MDR-TB）快速诊断为HainLifescience公司专利。该技术采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群利福平（rpoB）和异烟肼（katG和inhA）等结核治疗药物的耐药基因来判断TB体内耐药性。6h报告结核分枝杆菌复合群鉴定与耐药结果。能快速检测RFP和INH的耐药；时间短、操作简单、安全高；特异性和灵敏度较高、重复性好；主观因素影响小、更为可靠。不足的地方有不能检测所有药物的耐药基因型；缺少ahpC-oxyR间隔序列范围；不能取代传统细菌学检测、只能作为参考。

全基因组（whole-genomesequencing，WGS）：是采用高通量测序仪对微生物的基因组核酸测序，以获取该细菌全部基因组DNA序列的方法。由于MTB自发突变率低，可以采用全基因组测序来分析菌株间单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)差异，然后通过SNP对MTB进行菌种鉴定、判断其传播方向分辨复发与再感染或混合感染。全基因组测序的优点为可以更准确、全面地诊断出MTB的菌种、基因突变位点及其耐药信息等，缺点为依赖细菌培养技术、分析流程繁琐、数据量大、现有研究结果异质性大等。

宏基因组（metagenomicsnext-generationsequencing,mNGS）:孙雯雯等对宏基因组二代测序对不同类型结核病的诊断价值进行研究，以临床诊断结果作为参考标准，mNGS诊断结核病的敏感度为60%（99/，95%CI为0.53~0.67），特异度为%（40/40，95%CI为0.90~1.00），阳性预测值为%（99/99，95%CI为0.95~1.00），阴性预测值为38%（40/，95%CI为0.29~0.48）。mNGS诊断肺结核的敏感度为59%（59/），显著高于涂片法（15%，15/）和培养法（26%，26/），差异均有统计学意义（均P0.），但与Xpert法（52%，52/）比较差异无统计学意义（P=0.）；mNGS诊断肺外结核的敏感度为62%（40/65），显著高于涂片法（5%，3/65）、Xpert法（31%，20/65）及培养法（18%，12/65），三者比较差异均有统计学意义（均P0.）。mNGS法检测MTB快速、高效，对于结核病特别是肺外结核病的诊断优于其他常用的诊断方法。

纳米孔测序：???近年来，一种名为MinION的便携式测序仪出现在广大科研人员面前。这种便携测序仪质量不到g，能够通过USB数据线连接至电脑，且其测序结果与IIIumina台式测序仪一样准确。Votintseva等采用直接从痰液样本中提取MTB的DNA进行WGS，结果发现该方法检测结果与痰培养检测结果都能达到%，且能够检出MTB对抗生素的抗性特征。

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